氨基比林-N-脱甲基酶 AND试剂盒说明书
测定意义
细胞色素P450酶是一组在外源物质代谢中，尤其是药物和毒物，具有重要作用的酶系。AND作为P450酶系的重要一员，相当于CYP3A4亚型，与药物的去甲基化反应密切相关。
测定原理
AND催化氨基比林释放甲醛，通过Nash比色法测定甲醛含量，即可计算出AND活性。
自备仪器和用品
可见分光光度计、普通离心机，超速离心机、水浴锅、可调式移液器枪、1mL玻璃比色皿、蒸馏水、无水乙醇和冰。
试剂组成和配置
试剂一：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加100mL蒸馏水充分溶解。
试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。
试剂三：粉剂×1瓶（棕色瓶），4℃保存。临用前加入2.6mL无水乙醇，充分溶解。
试剂四：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入2.6mL蒸馏水，充分溶解。
试剂五：粉剂×1瓶，室温保存。临用前加蒸馏水10mL充分溶解。
试剂六：液体×1瓶，室温保存。
试剂七：液体×1瓶，4℃保存。
标准液：液体×1瓶，-20℃保存。临用前取1.5mL EP管，加入10ul标准液，加990ul蒸馏水，混匀即为0.05mmol/L标准甲醛溶液，4℃保存。
粗酶液提取
1、除去细胞核，线粒体等大分子物质：称约0.5g组织，加入1mL试剂一，冰上充分研磨，10 000g4℃离心30min，取上清液转入超速离心管。
2、粗制微粒体：4℃，100 000g，离心60min，弃上清液。
3、除血红蛋白等杂质：向步骤2的沉淀中加1mL试剂一，盖紧后充分振荡溶解，100 000g离心30min，弃上清液。
4、最终微粒体：向步骤3的沉淀中加试剂二0.5mL，盖紧后充分振荡溶解，即粗酶液，待测。该待测液需当天使用。
AND活性测定操作：
1、分光光度计预热30min以上，调节波长到412nm，蒸馏水调零。
2、试剂二置于37℃水浴中预热30min以上。
3、空白管：取1支EP管，加入50uL粗酶液，850uL试剂二，50uL试剂三，50uL蒸馏水，混匀后置于37℃水浴保温30min；立即加入175uL。试剂五，混匀后置于水浴中5min：取出后加入175uL。试剂六，混匀后室温静置5min；室温8000rpm离心5min：取新的EP管，加入500uL上清液，500uL。试剂七，混匀后60℃水浴10min，然后取出，用冷水冷却5min，于412nm测定光吸收，记为A空白管。每个样品都需要做空白管。
4. 测定管： 取 1 支 EP 管 加入 50µL 粗酶液 850µL 试剂50µL 试剂50µL 试剂四
混匀后置于 37℃水浴保温 30min 立 加入 175µL 试剂五 混匀后置于冰浴中 5min 取出后加入 175µL 试剂混匀后室温静置 5min 室温 8000rpm 离心 5min 取 1 支新 EP 管
加入 500µL 清液 500µL 试剂七 混匀后 60℃水浴 10min 然后取出 用冷水冷 5min
于 412nm 测定光吸收 记为 A 测定管
5.标准管 取 1 支 EP 管 加入 500µL 标准品 500µL 试剂七 混匀后 60℃水浴 10min
然后取出用冷水冷却5min，于412nm测定光吸收，记为A标准管。
AND活性计算
（1）、按照蛋白浓度计算
活性单位（U）定义：37℃中每分钟每毫克蛋白催化产生1umol甲醛。
AND活性（U/mg prot）=C标准品×V标准品×（A测定管-A空白管）÷（A标准管-A空白管）×稀释倍数÷（Cpr×V样）÷T=0.045×（A测定管-A空白管）÷（A标准管-A空白管）÷Cpr。
（2）、按照样本质量计算
活性单位（U）定义：37℃中每分钟每克样品催化产生1umol甲醛。
AND活性（U/g）=C标准品×V标准品×（A测定管-A空白管）÷（A标准管-A空白管）×稀释倍数÷（W×V样）÷T=0.045×（A测定管-A空白管）÷（A标准管-A空白管）÷W
C标准品：0.05mmol/L=50umol/L：V标准品：500uL=0.0005L；稀释倍数：V反总÷V上清液=（50+850+50+50+175+175）÷500=2.7：Cpr：粗酶液蛋白质浓度mg/mL，需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒：V样：加入粗酶液体积，50uL=0.05mL：W：样本质量，g：T：反应时间，30min。
注意事项：
1、粗酶液需在当日完成测定，如需保存，则向粗酶液提取步骤3的沉淀中加0.5ml20%的甘油。分装后，-80℃保存。
2、试剂三和试剂四需临用前配制，如当天没有用完，4℃避光保存，可用1周。
3、粗酶液可直接用于蛋白浓度测定，建议用BCA法测蛋白含量。
