实验窄制备单核苷酸一般用化学水解法(酸、碱水解)和酶解法。RNA用酸水解可得到嘧啶核苷酸和嘌呤碱基；用碱水解可得到2’～核苷酸和3’～核苷酸的混合物(比例2；3)；用5L磷酸二一酯酶或3L磷酸二i酯酶水解则分别可得到5’一核苷酸或3’一核苷酸本实验采用碱水解法。一般情况下磷酸二酯键对碱是比较稳定的，但由于RNA分子中核糖的2’羟基的邻接基团效应，使RNA分子中的磷酸二酯键变得对碱不稳定，因此，RNA可以用碱水解，经过2’，3’一环核苷酸中间物，生成2L核苷酸和3’一核苷黢。碱水解的方法很简单，一般用0．3N KOH，37℃保温18小时就能水解完全。水解毕，用高氯酸HCl0。中和，，{三成高氯酸钾KCl0。沉淀，离心去除沉淀，上清液即为各单核苷酸的混合液。成溶解度较大的高氯酸钠，使水解液中的钠离子无法除去。当水解液中的单核苷酸与离子交换树脂上的活性基团进行交换反应时，钠离子将与单核苷酸起竞争作用，影响单核苷酸交换反应的进行。而使用氢氧化钾，则中和水解液时生成的高氯酸钾溶解度小，产生沉淀，容易离心除去。氢氧化钾应在临用前配制，因为氢氧化钾溶液久置会吸收空气中的二氧化碳生成碳酸盐。碳酸盐混入水解液后，在酸性条件下进行离予交换层析时会生成二氧化碳，从而在柱中形成气泡。RNA碱水解液调至pHl．5上柱，此时，核苷酸的磷酸基团因进行一级解离而带负电荷，二级解离不能进行；UMP无NH=基，GMP、CMP和AMP的一NH=基各有不同程度的解离而带正电荷。各核苷酸所带净电荷如下：UMP为一0．75，GMP为0，CMP为+0．16，AM P为+0·19。显然，UMP因不带正电荷不与树脂上阳离子发生交换而直接流出，GMP净电荷为0，依靠嘌呤环与树脂母体之间的辅助性吸附力吸附于树脂上，CMP和AMP则因带正电荷与树脂上阳离子发生交换而被吸附，同时也有不同程度的辅助性吸附力存在。洗脱过程中，逐渐升高pIj。在pH2—5之问，由于一NH=解离pK值的不同而使各核苷酸所带的净电荷产生明显差异，同时也由于核苷酸与树脂之间非极性吸附力存在着差异，因此使各核苷被先后洗脱下来，从而达到分离的目的。由于各厂家出品的树脂性能不完全相同，因此，应根据实际条件选择不同的洗脱液。本实验在样品上柱后，先用pHl．5的HCI溶液洗脱，待UMP全部流出后，再换用pH3．5的HCI(o．0003N)溶液洗脱。根据备核苷酸所带净电荷的差异，洗睨次序应为UMP--GMP--AMP--CMP，但由于聚苯乙烯树脂母体对嘌呤碱的辅助性吸附力大于对嘧啶碱的吸附力，因而使AMP与CMP的洗脱位置互换，实际洗脱顺序为uMP—GMP--CMP--AMP若用阴离子交换树脂分离，可将上柱样品液调到pH8，使各核苷酸带负电荷而被吸附上柱，洗脱时则逐步降低pH，使各核苷酸分别洗脱下来。DNA对碱稳定，一般情况下不被碱水解，对酸不太稳定，若用稀酸温和水解得到的是脱嘌呤酸和嘌呤碱基，用浓酸水解则得到游离碱基。因此，实验室制备脱氧单核苷酸只能采用酶解法。用5L磷酸二酯酶或3’一磷酸二酯酶水解DNA可分别获得5’-或3’-脱氧单核苷酸。本实验用桔青霉5L磷酸二酯酶(即Nuelease PI)水解鱼精DNA，得到5L脱氧单核苷酸。该酶的最适pH为4．5—6．0，最适温度为70℃～80℃，锌离子有激活作用。以双链DNA作酶反应底物时，水解速度极慢，因此，在酶解前必须先将DNA热变性。该酶制剂中往往混有磷酸单酯酶，它会将5L脱氧单核苷酸水解成无机磷酸和脱氧核苷，但此酶作用的最适温度为45℃，因此通过控制酶解温度就可在一定程度上抑制单酯酶对5’一脱氧单核苷酸的分解，从而得到较多量的51-脱氧核苷酸。10微升微量进样器1支，分析天平，751G型分光光度计；电热恒温水浴锅}离心沉淀器，
2．  材料
(1)  鱼精DNA(上海长阳制药厂产品，纯度约80％<紫
外法>法见附)
 3．  试剂
(1)0．5MpH5．6乙酸盐缓冲液
(2)0．1MZnCl2
(3)5’一磷酸二酯酶酶液(2000单位／毫升)：称取酶
(16万单位／克)12毫克，溶于l毫升0．5MpH5．6乙酸盐缓
冲液中，置4℃冰箱存放。
 (4)市售粗食盐
(5)  冰
1．DNA溶液配制t在分析天平上称取鱼精DNA 10毫克，置1．5 X 10厘米小试管中，加入0．8毫升蒸馏水，用玻棒磨片刻后，室温放置过夜使溶解。
2．DNA热变性将装有上述DNA溶液的小试管置lOO℃沸水浴中保温10分钟(先保温1—2分钟，塞上木塞后继续保温)，取出置千冰一丙酮或盐冰浴(250毫升烧杯内放冰块，再撒粗盐若干)中骤冷。
3．酶解 将变性DNA溶液置于70。C恒温水浴中预热2分钟，加入0．1毫升0．5MpH5．6乙酸盐缓冲液，10微升0·IMZnCI。溶液和0．1毫升5L磷酸二酯酶酶液(2000单位／毫升)。反应系统中各物质终浓度为：lOmg／mlDNA，0．05M乙酸盐缓冲液，0．001MZn”，200单位／毫升酶。混合均匀后于70。C恒温水浴中保温2．5小时。
4．  终止酶解将上述反应液从70℃水浴中取出，立即置沸水浴中保温10分钟，终止酶反应。