微生物染色方法一般分为单染色法、复染色法、特殊染色法及负染色法。单染色法是用一种染料使微生物染色，但不能鉴别微生物；复染色法则采用两种或两种以上的染料，将不同微生物染成不同颜色以鉴别微生物，常用的有革兰染色法和抗酸染色法；负染色法则使微生物背景着色；特殊染色法可将细菌各部分结构染成特定颜色。实验材料方法一 革兰鉴别染色法1．菌种：大肠杆菌，枯草杆菌(经20h培养的肉汁斜面或平板培养物)革兰染色各步骤的作用及结果为革兰染色程序表。 革兰染色程序操作步骤和使用的试剂处理时间
与细胞所起的反应镜检细胞观察到
的现象革兰阳性细菌(G+)革兰阴性细菌(G—)涂片与火焰固定细胞蛋白质疑固与革兰阳性菌相同无色甲紫染色45—60s1．染料为细胞吸附，
以结合和不结合
两种形式吸附2．细胞成紫色与革兰阳性菌相同紫色碘液染色(媒染)1rain1．碘反应，即可能固
定结合或不结合
甲紫2．形成一种碘甲紫
复合沉淀物3．细胞仍为紫色与革兰阳性菌相同紫色脱色(乙醇或乙醇丙酮混合物)小心地一滴一滴地点到标本上，直到不出现紫色液溢出1．脱色液引起碘甲
紫复合物离解2．复合物的成分成
为可溶性3．厚的细胞壁呈现
脱水4．染料的扩散慢慢
进行l，2．与革兰阳性菌
相同3．薄的细胞鞘呈现
脱水4．染料的扩散很快
进行革兰阳性紫色革兰阴性无色复染(蕃红或稀的石炭酸复红)0．5一lmin1．稍有出现甲紫被
取代，但总的细胞
群不受影响2．细胞呈现紫色或
红色1．原甲紫染色部位
被取代2．细胞被复染3．细胞呈红色革兰阳性紫色革兰阴性红色
在进行革兰染色中有时结果不稳定，主要的原因是脱色时间掌握不当，涂片太厚，或菌龄太长，一般采用20—24h的培养物。染色操作步骤及注意点
从革兰染色法可以看到染色操作包括制片、固定、染色、媒染、脱色、复染、水洗、干燥等步骤，每一步都具有其操作要点和注意点，若不当心，可能就得不到满意的结果。
1．制片：制片要采用干净的载玻片，并注意接种环的无菌操作。做斜面菌体片时，要防止菌体和水混合不均匀有结团现象，注意菌体量适中。
2．固定：涂片后最好先在室温下自然干燥，然后固定。固定的目的是：①杀死微生物，固定其细胞结构；②保证菌体能牢固地黏附在载玻片上，因而可防止标本被冲洗掉；③改变菌体对染料的通透性，一般使死细胞原生质染色。
(1)固定常用高温，手执载玻片一侧，标本面朝上，在火焰外层快速来回通过3—4次。共约3—4s，要求玻面温度不超过60~C，此时以手背皮肤接触不觉过烫为度。放置待冷后染色。由于热固定会改变细胞的内部结构及外形，所以研究菌体细胞结构时常采用化学固定法。 、
(2)常用的化学固定剂有：95％乙醇、乙醇和醚1：l的混合液、丙酮、l％一2％饿酸液。适用于固定丝状菌的固定液介绍两种：①铬酸一醋酸一饿酸液：铬酸坨，冰醋酸坨，l％饿酸lml；②铬酸一醋酸一甲醛溶液：1％铬酸80ral，冰醋酸5ml，甲醛溶液15ml。
锇酸能很快固定细菌细胞而不改变其结构，因此用它来固定微生物细胞很方便。
3．媒染与染色：标本固定以后，滴加染色液，使整个标本固定在染色液中。染色时间视标本与染料的性质而定，有时还需加热。一般染色时间为l一3rain。
如作复合染色，要在染色前作媒染处理。媒染剂与染料能形成不溶性的化合物，它能增加染料和细胞的亲和力(表12—3)。媒染一般在固定后进行，但也可结合固定或染色同时进行。表12-3 各种媒染剂的作用媒染液名称 作 用醋酸(少量)氯化钡(2％一4％)硅钨酸(4％水溶液)碳化铿(少量)碘和苦味酸增加曙红、胭脂红的染色酸性染色剂的染色碱性染色剂的染色增进减性染料染色各种紫色染媒，染色后用
4．脱色与复染：一般脱色都用醇类和酸类处理，通常可以检查染料与细胞结合的程度。用以鉴定菌类，常见的脱色剂是95％的乙醇，3％的盐酸液。
脱色后需再用一种染色剂染色，它能与脱色的部分形成鲜明对比，便于区别观察。革兰染色中可以用萎红液或石炭酸品红等作复染液。
5．水洗与干燥：染色时间一到，就应用细小的缓流水将多余染料从标本上洗去，但不要将细胞所吸附的染料洗去。洗净后，将标本放置桌上风干，也可用吸水纸轻轻吸去水分。有时也可微微加热，待干后再镜检。
6．标本玻片的封藏：标本镜检后，有时需要长期保存，这时应将标本封存。常用的制片黏着剂是加拿大胶，其制法是：混合等量的干加拿大胶和碳酸氢钠在乳钵内磨碎，加入等量二甲苯，制成透明溶液，约l周后过滤，并微热，使溶液具适当稠度。保存在暗处，并外涂黑色。将此液滴加到标本中，上盖清洁盖玻片，压平，待干，保存。用此种中和性的加拿大胶保藏标本，不易褪色。
与细胞所起的反应镜检细胞观察到
的现象革兰阳性细菌(G+)革兰阴性细菌(G—)涂片与火焰固定细胞蛋白质疑固与革兰阳性菌相同无色甲紫染色45—60s1．染料为细胞吸附，
以结合和不结合
两种形式吸附2．细胞成紫色与革兰阳性菌相同紫色碘液染色(媒染)1rain1．碘反应，即可能固
定结合或不结合
甲紫2．形成一种碘甲紫
复合沉淀物3．细胞仍为紫色与革兰阳性菌相同紫色脱色(乙醇或乙醇丙酮混合物)小心地一滴一滴地点到标本上，直到不出现紫色液溢出1．脱色液引起碘甲
紫复合物离解2．复合物的成分成
为可溶性3．厚的细胞壁呈现
脱水4．染料的扩散慢慢
进行l，2．与革兰阳性菌
相同3．薄的细胞鞘呈现
脱水4．染料的扩散很快
进行革兰阳性紫色革兰阴性无色复染(蕃红或稀的石炭酸复红)0．5一lmin1．稍有出现甲紫被
取代，但总的细胞
群不受影响2．细胞呈现紫色或
红色1．原甲紫染色部位
被取代2．细胞被复染3．细胞呈红色革兰阳性紫色革兰阴性红色
在进行革兰染色中有时结果不稳定，主要的原因是脱色时间掌握不当，涂片太厚，或菌龄太长，一般采用20—24h的培养物。染色操作步骤及注意点
从革兰染色法可以看到染色操作包括制片、固定、染色、媒染、脱色、复染、水洗、干燥等步骤，每一步都具有其操作要点和注意点，若不当心，可能就得不到满意的结果。
1．制片：制片要采用干净的载玻片，并注意接种环的无菌操作。做斜面菌体片时，要防止菌体和水混合不均匀有结团现象，注意菌体量适中。
2．固定：涂片后最好先在室温下自然干燥，然后固定。固定的目的是：①杀死微生物，固定其细胞结构；②保证菌体能牢固地黏附在载玻片上，因而可防止标本被冲洗掉；③改变菌体对染料的通透性，一般使死细胞原生质染色。
(1)固定常用高温，手执载玻片一侧，标本面朝上，在火焰外层快速来回通过3—4次。共约3—4s，要求玻面温度不超过60~C，此时以手背皮肤接触不觉过烫为度。放置待冷后染色。由于热固定会改变细胞的内部结构及外形，所以研究菌体细胞结构时常采用化学固定法。 、
(2)常用的化学固定剂有：95％乙醇、乙醇和醚1：l的混合液、丙酮、l％一2％饿酸液。适用于固定丝状菌的固定液介绍两种：①铬酸一醋酸一饿酸液：铬酸坨，冰醋酸坨，l％饿酸lml；②铬酸一醋酸一甲醛溶液：1％铬酸80ral，冰醋酸5ml，甲醛溶液15ml。
锇酸能很快固定细菌细胞而不改变其结构，因此用它来固定微生物细胞很方便。
3．媒染与染色：标本固定以后，滴加染色液，使整个标本固定在染色液中。染色时间视标本与染料的性质而定，有时还需加热。一般染色时间为l一3rain。
如作复合染色，要在染色前作媒染处理。媒染剂与染料能形成不溶性的化合物，它能增加染料和细胞的亲和力(表12—3)。媒染一般在固定后进行，但也可结合固定或染色同时进行。表12-3 各种媒染剂的作用媒染液名称 作 用醋酸(少量)氯化钡(2％一4％)硅钨酸(4％水溶液)碳化铿(少量)碘和苦味酸增加曙红、胭脂红的染色酸性染色剂的染色碱性染色剂的染色增进减性染料染色各种紫色染媒，染色后用
4．脱色与复染：一般脱色都用醇类和酸类处理，通常可以检查染料与细胞结合的程度。用以鉴定菌类，常见的脱色剂是95％的乙醇，3％的盐酸液。
脱色后需再用一种染色剂染色，它能与脱色的部分形成鲜明对比，便于区别观察。革兰染色中可以用萎红液或石炭酸品红等作复染液。
5．水洗与干燥：染色时间一到，就应用细小的缓流水将多余染料从标本上洗去，但不要将细胞所吸附的染料洗去。洗净后，将标本放置桌上风干，也可用吸水纸轻轻吸去水分。有时也可微微加热，待干后再镜检。
6．标本玻片的封藏：标本镜检后，有时需要长期保存，这时应将标本封存。常用的制片黏着剂是加拿大胶，其制法是：混合等量的干加拿大胶和碳酸氢钠在乳钵内磨碎，加入等量二甲苯，制成透明溶液，约l周后过滤，并微热，使溶液具适当稠度。保存在暗处，并外涂黑色。将此液滴加到标本中，上盖清洁盖玻片，压平，待干，保存。用此种中和性的加拿大胶保藏标本，不易褪色。
