单克隆抗体（McAb）要用体外细胞培养建立永久性产生的抗体的细胞株的方法制备目前多用人、鼠的致敏B淋巴细胞与小鼠的骨髓瘤细胞（Sp2 O .NS（等）融合。使之在体外无限制生长产生抗体。
首先要用抗原面议动物，已得到致敏B淋巴细胞。或者由人体内选取淋巴结，外周血或病原组织的致敏B细胞。用这些细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合，建立产生McAb的永久性细胞株。目前虽有用人致敏淋巴细胞与人骨髓瘤细胞进行杂交，建立人-人杂交瘤技术的报道，但是很不稳定。一般用于面议组织化学的McAb.基本上都是用小鼠-小鼠杂交瘤制备的。
免疫动物用Balb/c纯种小鼠。免疫方法即途径如前，但多经腹腔注射30-50ug可溶性抗原。并与等量完全或不完全佐剂混合。也有人经静脉或脾免疫小鼠。但经血路免疫时应注意有发生变态反应的危险。用细胞免疫时。细胞数以
为好。不要低于
。经一次或二次免疫后，可从眼静脉放血检测血清中有无抗体存在，若有可见的琼脂双扩散效价，则于最后一次经静脉加强免疫3天后由眼静脉放血杀死动物，取脾植被脾细胞悬液。这时的脾B细胞已被激活。病能产生的抗体，是细胞融合的最佳状态。杀死动物手机血清可留作多克隆抗体(PcAt)对照血清。
用作细胞融合的小鼠骨髓瘤细胞Sp2/o细胞系从小鼠骨髓瘤细胞培养的无分泌Ig能力的细胞系。在融合前，应在培养基中加8-氮鸟嘌呤。经2-3次代传，以增加其对选择培养基中的氨甲喋呤敏感性后才能使用。融合前的Sp 2/O细胞应生长活跃。换液后1-2天，即可长满培养瓶。冲洗并收集起来经过稀释后。在血细胞计数器中计细胞总数（细胞总数为
x 每大格细胞平均数 x 稀释倍数 x 体积ml数）。一边取一定数量与脾细胞融合。脾细胞来自已免疫的Baib/c小鼠。进行融合前将小鼠外部消毒后取脾。放在预先置好的小杯上的率网上，剪成碎片。并将单纯培养液将脾细胞通过滤网冲入培养基中成为脾细胞悬液，按上法计每ml的脾细胞数及总数。
按1：2-1:10的比例混合骨髓瘤细胞及脾细胞。离心1000rpm。5分钟。继而轻击管底使细胞重新悬浮。并将1ml的聚乙二醇在1分钟内缓缓滴加在混合细胞中，并轻轻用吸管吹打数次(PEG）是一种促溶剂。能改变细胞膜促进细胞融合。
放置2分钟后，加1ml单纯培养液。徐徐转动试管使均匀混合以终止反应。在放置5分钟。离心去掉上清后，用选择性培养液（HAT）稀释之。使每ml中含5x
个细胞 最后用吸管移入96孔板中，每孔0.2ml。置37℃ 5% CO2孵箱中培养。
经融合的细胞悬液中，有已经融合的细胞，也有没有融合的细胞。而融合的细胞中。有脾细胞 脾细胞的融合细胞。有骨髓瘤-骨髓瘤细胞的融合细胞，当然也有骨髓瘤细胞与脾细胞的融合细胞。必须选择骨髓瘤-脾细胞的肉能杂交细胞。
选择培养的关键是单纯培养液中加添HAT选择培养液。这个培养液中的H是次黄嘌呤，A是氨甲喋呤 T是胸腺嘧啶核苷 A可以阻断所有细胞通过正常途径合成DNA的途径，这样细胞就会死亡 幸而培养液中还包括有H及T。假若细胞中有次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT酶），就有可能通过HGPRT酶转化H而合成DNA，若细胞中还有胸腺嘧啶激酶(TK)酶。它又能利用T来合成DNA（抢救途径）。而维持细胞增殖不治死亡。骨髓瘤细胞缺乏这两种酶，所以在选择培养基内必然死亡。脾细胞有这两种酶。但脾细胞在培养条件下如无致裂原及其生长因子存在，液无法生长。只有脾细胞-骨髓瘤细胞的融合细胞。既有这两种酶又能无限制生长。所以在HAT培养集中得到顺利增殖，此即选择培养 但是，选择后生长起来的并不是单克隆的。也有可能是多克隆的。所以必须克隆化。建立 真正的但克隆细胞系。
克隆化就是分离出单个细胞。使其通过分裂增殖而获得一个遗传特性十分均一的细胞全体的全部过程。经过数次克隆化以后，才可能选育出单克隆细胞系。克隆化的方法有二。有限稀释法，即将含有一定数量的细胞悬液，经过多次倍比稀释，由1:2/1:4,1:8,1:16,1:32,1:64 直至稀释到微孔培养板中每孔可能只含一个细胞的浓度，放在CO2孵箱内是之增殖，这样可能得到单克隆抗体细胞系。但是一次克隆化往往不能达到目的。一般需要重复三次以上，2、显微操作法，在显微镜下用吸管吸出单个细胞进行培养。
在克隆化时，必须进行抗体检测，以确定是否得到了单克隆细胞系。当把一个产生所需抗体的阳性培养孔中的细胞进行有限稀释并分别移至96孔板上生长时，若发现部分孔培养后细胞分泌抗体。部分孔不分泌抗体。说明至少还有两个克隆的细胞同时存在，还需要进一步克隆化，若克隆化以后。所有孔都产生同样抗体，则大致说明可控化已经完成。所以克隆化与抗体检测工作需密切配合。
检测抗体是鉴定和筛选所需克隆的极重要的一步。目前常用的检测方法有免疫组织化学。酶联免疫吸附试验（elisa）以及放射免疫或免疫放射法。检测方法选择应服从于所制备的单克隆抗体的主要目的和用途，最好将用途与检测方法结合，如主要用于免疫组织化学。可用elisa或放射免疫方法筛选 若所制抗体主要用于ELISA或放射免疫，可用ELISA或放射免疫方法筛选。单克隆抗体十分均一。不同抗体之间理化特性及类别可十分不同，并非每一单克隆抗体都同时可适用于elisa方式面议及面议组织化学等-但目前大多数人喜欢直接用免疫组织化学方法筛选。这是因为面议组织化学方法与其他方法比较不敏感。免疫组织化学方法能做出者。Elisa及放射免疫往往不成问题。反之，其他方法筛选的抗体，多数不能进行面议组织化学染色。所以。为了稳妥起见。多选用免疫组织化学方法。常用石蜡包埋的组织筛选。但面议组织化学筛选的抗体也不一定能作其他用途。
常用的免疫组织化学方法。可根据条件选用固定液。用冰冻切片还是石蜡切片。也因抗原不同而又所选择。因此，不能只使用一种方法、一种固定液就轻易宣布无所需的阳性克隆存在。同时抗体检测常需在短期内完成。实现要充分准备，以免丢失所需阳性克隆 虽然石蜡切片比冰冻切片检测的敏感性差，但机构清洗。需注意三方面的问题：1、用保存抗原好的固定剂如：乙醇、甲醇、丙酮、Bouin氏液以及种性缓冲福尔马林。2、用快速或低温石蜡包埋。为了快速。就要把组织块切成2x5 x5mm的小块。这样经过2-4小时的固定。透明、包埋及切片即可完成制片工作。为了更好地保存抗原活性采用碳蜡包埋，就更容易筛出抗体。3用敏感简便的染色方法。如ABC法。有利于检测培养上清中微量的抗体。
在细胞融合及克隆化阶段，细胞基本上是微孔培养板上生长。每孔细胞数有限。所能产生的抗体量极微。扩大培养的方法很多，如用25ml培养瓶培养。抗体产量就可以扩大近100倍。单用500ml及1L的培养瓶时，培养瓶及培养液必需不断转动，细胞才能吸收足够的CO2与O2，存活良好。这些方法即微管、微球法。都是向工业化生长过渡的方法。实验室内最常用的是吧杂交瘤细胞接种在小鼠腹腔内。5天后腹水逐渐增多。其中含抗体浓度很高，去除腹水，就可以得到大量的抗体。
McAb是针对抗原的某一抗原决定簇的,与PcAb针对抗原的许多决定簇不同。他是与抗原的一个结合点反应，所以是单价的。而PcAb可与抗原的许多决定簇发生反应。克隆抗体的分子结构式相当一致的，与抗原起反应的轻链，即可变区的氨基酸序列比较窄，但比PcAb的反应特异。PcAb与抗原结合点多。结合力打，所以与抗原的亲和力较强。因此，一般PcAb免疫组化染色较强，更加稳定不容易洗脱，但往往引起较重的非特异直接面议组织化学染色的更好的条件。假若进行琼脂双扩散，只有少数McAb与抗晕能形成可见的沉淀线。而PcAb与抗原发生可见的沉淀反应。有人认为这是因为McAb与抗原结合的复合物，在立体结构上简单化一，不如PcAb与抗原的结构复杂。用作放免时，有些McAb不能标记。因而就不能再放免法中应用。
分泌McAb的细胞株，一单建立并保持稳定，就能源源不断的大量的常胜质地均一、功能相同、不易波动的McAb。因而可以宝成使用它的哥哥实验室都能得出同样的实验结果，也就是容易标准化，使用PcAb则很难做到。现将McAb与PcAb之间的差别列表如下：
