革兰氏染色法的原理至今还不完全清楚，解释不一。其染色结果受多方面因素影响，主要与被检细菌本身特性、培养基成分、培养条件、菌龄、菌细胞壁完整性和染色时的操作技术有关。分述如下：

一、细菌本身特征：如葡萄球菌、梭状芽孢杆菌因易脱色，常偏红或呈阴性：白喉杆菌和结核杆菌染色反应亦介于阳性和阴性之间，称弱阳性，成淡紫红色。

二、培养基成分：革兰氏言行菌含有多量的核糖核酸镁盐，与进入菌体内的结晶紫和碘液结合成大分子的复合物，不易脱出，故革兰氏言行菌摄取结晶紫多且牢固，呈紫色。革兰氏阴性菌含核糖核酸镁盐甚少，故依托色，成负染剂颜色-红色。在缺乏镁盐的培养基中的培养的革兰氏阳性菌可成为革兰氏阴性。

如培养基中计入青霉素，因其干扰细菌细胞壁的合成，亦可成阴性

三、培养条件：在培养基PH不适宜时，细菌电荷改变，染色的结果也发生改变。因革兰氏阳性菌的等电点（ph2-3）比革兰氏阴性菌的等电点（ph4-5）低，在一般PH为7.2-7.6的培养基中阳性菌所带负电荷较阴性菌多，因此，容易和带正电荷的碱性燃料结合，不易脱色。否则，如培养基PH降低，使阳性菌可变为阳性。但事实上影响不大，因PH过高或过低一般细菌均不能生长繁殖。

四、菌龄：菌龄能影响染色结果。阳性菌含核算两较多，所以一结合染料，呈阳性；若革兰氏阳性菌的核算减少，可能变为阴性。陈旧培养物因核酸含量降低，故革兰氏阳性菌，往往染色呈阴性。

五、菌细胞壁的完整性：革兰氏阳性菌细胞壁破损或缺乏者（如L型菌）也呈阴性反应。因革兰氏阳性菌细胞壁致密，含粘肽（即肽聚糖）多，在95%酒精中导致细胞壁脱水，通透性下降不易脱色；如胞壁破损或缺乏，则进入菌细胞而脱色。脓细胞中的革兰氏阳性菌，因被吞噬变为阴性。

六、操作技术：涂片太厚，细菌重迭，究竟脱色不均匀，其中部分革兰氏阴性菌可呈紫色。如究竟脱色时间太长；或第一步染色冲洗后，片子上残留水分过多使酒精时间太长；或第一步染色冲洗后，骗子上残留水分过多使酒精浓度减低，将会增强脱色力，使革兰氏言行菌显阴性反应。因75%酒精的脱色力较95%酒精的强。转染试剂

    此外，染色液贮存过久，以及其他各个染色步骤的时间过长或不够，也都会有性腺染色反应的结果。如初染液配制过久，因水分蒸发而染料浓度提高，易使阴性菌呈阳性反应；碘液放置过久，碘挥发，媒染作用不好，则阴性菌呈阴性反应；又如结晶紫染色过长或脱色时间太短，均可使阴性变为阳性。
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