动物细胞培养在单克隆抗体制备中的应用
抗体作为疾病预防、诊断和治疗的制剂已有上百年的发展历史。早期制备抗体的方法是将某些天然抗原经各种途径面议动物，成熟的B细胞可控受到抗原刺激后，将抗体分泌到血清和体液中。实际上血清中的抗体是多种单克隆抗体的混合物，因此称之为多克隆抗体。多可控抗体 是人类有目的利用抗体的第一步。多克隆抗体的不均一性，限制了对抗体结构和功能的进一步研究和应用。1975年Kohler和Milstein首次用B淋巴细胞杂交瘤技术制备出均一性的单克隆抗体获1984年诺贝尔奖。杂交瘤技术的诞生被认为是抗体工程发展的第一次质的飞跃，也是现代生物技术发展的一个里程碑。利用这种技术这杯的单克隆抗体的疾病诊断、治疗和科学研究中得到广泛的应用。抗体所针对的抗原包括半抗原、具有生物活性的天然产物、神经肽、激素、酶和其他蛋白、糖蛋白、脂蛋白、脂多糖、核酸、组织相容性抗原、分化抗原、自身抗原、细胞表面粘附分子等。这些抗原可以来自病毒、支原体、细菌、原虫、寄生虫、正常细胞及肿瘤细胞。
杂交瘤抗体技术的基本原理是通过融合两种细胞而同时保持两者的主要特征。这两种细胞分别是B淋巴细胞和经抗原免疫的小鼠细胞做小鼠骨髓瘤细胞。B淋巴细胞的主要特征是它的抗体分泌功能和能够在选择培养基中生长（选择远离见后），小鼠骨髓瘤细胞则可在培养条件下无线分裂、增殖、即所谓永生性。在选择培养基的作用下，只有B瞎报与骨髓瘤细胞融合的杂交才具有持续增殖的能力，形成同时具备抗体分泌功能和保持细胞永生性两种特征的细胞克隆。
细胞的选择与融合
建立在杂交瘤技术的制备针对抗原特异的单克隆抗体所以融合细胞一方必须选择经过抗原免疫的B细胞，通常来源于免疫动物的脾细胞。脾是B细胞聚集的中药场所，无论以何种免疫方式刺激，脾内皆会出现铭心啊的抗体应答反应。融合细胞的另一方则是为了保持细胞融合后细胞的不断增值，只有肿瘤细胞才具备这种特性。选择同一体系的细胞可增加融合的成功率。多发性骨髓瘤是B 细胞系恶性肿瘤。所以是理性的脾细胞融合伴侣。目前常用的B细胞瘤株有：P3-X63-Ag8，P3-NSI/1-Ag4-1,X63-Ag8. 563 Sp2/0-Ag14等，这些细胞株皆为HAT敏感细胞株。
使用细胞融合剂造成细胞膜一定程度的损伤，使细胞抑郁相互粘连而融合在一起。最佳的融合效果应是最低程度的细胞损伤而又产生坐高频率的融合。聚乙二醇是目前最常用的细胞融合剂，一般应用浓度为40%。
细胞融合是一个瑞吉的物理过程。在小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞呵呵细胞悬中，经融合细胞将以多种形式出现。如融合的脾细胞和瘤细胞、融合的细胞和脾细胞、融合的瘤细胞和瘤细胞、未熔合的脾细胞、未熔合的瘤细胞以及细胞的多聚体形式等。正常的脾细胞在培养基中存活仅5-7d，无需特别筛选，细胞的多聚体形式也容易死去。而为融合的瘤细胞则需要惊醒特别的筛选去除
细胞DNA合成一般有两条途径。主途径是由糖和氨基酸合成核苷酸，进而合成DNA，也算作为重要的辅酶参与这一合成过程。意义辅助途径是次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情况下，经次黄嘌呤、氨甲喋呤和胸腺嘧啶核苷，所以取三者的字头成为HAT培养基、其中氨甲喋呤是也算的拮抗剂，可阻断瘤细胞利用正常途径和成DNA，而融合所用的瘤细胞是经毒性培养基选出的HGPRT细胞株，所以不能再该培养基中生长。因此只有融合细胞具有亲代双方的遗传性能，可在HAT培养基中长期存活于繁殖。
在动物勉一中，应选用高纯度抗原。一种抗原往往有多个决定簇，一个动物在受到抗原刺激后产生的体液免疫应答，实质是众多B细胞群的抗体分泌。而针对目标抗原表位的B细胞只占极少部分。而且由于细胞融合是随机的过程，在已经融合的细胞中，有相当比例的无关细胞的融合体，因此需要筛选去除。筛选过程一般分为两步进行：意识融合稀薄啊的抗体筛选，而是再次基础上进行的特异性抗体筛选。将融合的细胞惊醒充分稀释，使分配到培养板的每一孔中的细胞数在0至数个细胞之间（30%的孔为0才能保证每个孔中是单个细胞），培养后取上清以ELISA法选出抗体高分泌性的细胞；这一过程常被习惯地称作单克隆。将这些阳性细胞在进行克隆化，应用特异性抗原包被的ELISA找出针对目标抗原的抗体阳性细胞株，增殖后进行冻存、体外培养或动物腹腔接种培养。
单克隆抗体的制备是一个复杂、精细的工艺。为对全过程有一个概括的了解，一般讲全过程分为三个阶段；免疫小鼠；建立筛选方法和程序；杂交瘤生成。
上图每一阶段都有可能迅速顺利完成，单个阶段也都有其本身的问题，需要在实验开始前予以充分考虑，以免影响全局。动物再注入抗原后，一旦出现良好的液体免疫应答，同时又已建立合用的筛选方法，病通过血清对所建立筛选方法进行评价、确定方法后，才可开始杂交瘤细胞的制备。其过程大致为；在细胞融合前数日，用抗原免疫动物；将从免疫动物得到的分泌抗体的细胞与骨髓瘤细胞想混，经行细胞融合（有效地细胞融合约可得1/10
存活的杂交细胞）；其后，将融合细胞用所选择的培养基限定稀释，置多空培养板进行培养，在细胞融合后1周，即可对杂交瘤进行测试，从阳性培养孔所取的细胞先增殖，然后，进行单克隆（即但可控生长），杂交瘤的生成与克隆需要时间，很少的实力只需要2个月，有的甚至要1年时间。因制备但可控抗体过程中每一步都对其后各步影响很大，因此均需zhuy8i选择最适宜的条件，如：要注意抗原的选择及其性质，如细胞、蛋白质、半抗原等；根据抗原得性质和得量和对抗体得要求等，计划及建立免疫的途径和方式；选定抗体筛选的测定方法必须简单、可重复、特异、并可适用于单克隆抗体的最终适用(即免疫荧光、免疫沉淀、功能试验等中的应用）要确定细胞培养的条件；细胞融合的方式应考虑杂交方法，细胞的选择和可控的方式等。
存活的杂交细胞）；其后，将融合细胞用所选择的培养基限定稀释，置多空培养板进行培养，在细胞融合后1周，即可对杂交瘤进行测试，从阳性培养孔所取的细胞先增殖，然后，进行单克隆（即但可控生长），杂交瘤的生成与克隆需要时间，很少的实力只需要2个月，有的甚至要1年时间。因制备但可控抗体过程中每一步都对其后各步影响很大，因此均需zhuy8i选择最适宜的条件，如：要注意抗原的选择及其性质，如细胞、蛋白质、半抗原等；根据抗原得性质和得量和对抗体得要求等，计划及建立免疫的途径和方式；选定抗体筛选的测定方法必须简单、可重复、特异、并可适用于单克隆抗体的最终适用(即免疫荧光、免疫沉淀、功能试验等中的应用）要确定细胞培养的条件；细胞融合的方式应考虑杂交方法，细胞的选择和可控的方式等。
