脱氢抗坏血酸还原酶（dehydroascorbate reductase，DHAR）试剂盒说明书
分光光度法 50 管/48 样
注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：
DHAR 存在于细胞质、线粒体和叶绿体中。DHAR 催化 GSH 还原 DHA 生成 AsA 和 GSSG，调控细胞 AsA/DHA 比值，是抗坏血酸-谷胱甘肽氧化还原循环的关键酶。提高植物体内的 DHAR 活性，可提高植物食品中 AsA 含量，进而提高植物食品的营养品质。
测定原理：
DHAR 催化 GSH 还原 DHA 生成 AsA，通过测定 DHA 减少速率，计算 DHAR 活性。
实验中所需仪器及设备：
研钵、冰、低温离心机、紫外分光光度计、1mL 石英比色皿、可调式移液器和蒸馏水。
试剂组成和配制：
试剂一：液体 50 mL×1 瓶，4℃保存。
试剂二：液体 35 mL×1 瓶，4℃保存。
试剂三：粉剂×1 瓶（棕色），4℃保存。临用前加入 5mL 蒸馏水充分溶解。
试剂四：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加入 5mL 蒸馏水充分溶解。
粗酶液提取：
1. 按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 试剂一）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心 10min，取上清置冰上待测。
2. 细菌、真菌：按照细胞数量（104 个）：试剂一体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议
500 万细胞加入 1mL 试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；8000g 4℃离心 20min，取上清液置冰上混匀待测。
3. 血清等液体：直接测定。
DHAR 测定操作：
1. 分光光度计预热 30 min，调节波长到 265nm，蒸馏水调零。
2. 试剂二在 25℃水浴锅中预热 30 min。
3. 在 1mL 石英比色皿中依次加入 100μL 上清液、100μL 试剂三、100μL 试剂四和 700μL 试剂二，迅速混匀后于 265nm 比色，记录 30s 和 150s 的吸光值 A1 和 A2，△A=A2-A1。
DHAR 活性计算公式：
(1). 按蛋白浓度计算
活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟还原生成 1nmol AsA 为 1 个酶活单位。 DHAR(nmol/min/mg prot) = △A÷ε÷d×V 反总×109÷(Cpr×V 样)÷T
= 92×△A ÷Cpr
(2). 按样本质量计算
活性单位定义：25℃中每克样本每分钟还原生成 1nmol AsA 为 1 个酶活单位。
DHAR(nmol/min/g 鲜重) = △A÷ε÷d×V 反总×109÷(W×V 样÷V 样总)÷T
= 92×△A ÷W
(3). 按细胞数量计算
活性单位定义：25℃中每 104 个细胞每分钟还原生成 1nmol AsA 为 1 个酶活单位。
DHAR(nmol/min/104 cell) = △A÷ε÷d×V 反总×109÷(细胞数量×V 样÷V 样总)÷T
= 92×△A ÷细胞数量
（4）按液体体积计算
活性单位定义：25℃中每毫升样本每分钟还原生成 1nmol AsA 为 1 个酶活单位。
DHAR(nmol/min/mL) = △A÷ε÷d×V 反总×109÷V 样÷T
= 92×△A
ε ：AsA 在 265nm 处摩尔吸光系数为 5.42×104 L/mol /cm；109：摩尔分子换算成纳摩尔分子；d：比色杯光径，1 cm；V 反总：反应体系总体积，1mL=0.001 L；V 样：反应体系中加入上清液体积，100μL =0.1mL；Cpr：上清液蛋白浓度，mg/mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；W，样本质量，g；T：反应时间，2 min。
注意事项：
临用前配制的试剂未使用完的 4℃保存，3 天内使用完。
