免疫荧光标本的制备
细胞标本的制作 根据实验对象不同而采用不同的方法，但最终均要使样品纯净，尽量减少杂质及碎片，并调整样品浓度为1×106细胞。唯外周血细胞需用白细胞分层液做梯度离心，取中间层洗净、计数应用，这是当前实验室常规。尽管大约有10%以下的单核细胞污染，在感染病人或怀孕妇女的血样品污染甚至高达20%，目前淋巴细胞免疫分型研究中，还是最理想的标本制作法。有人企图用多种手段去除单核细胞或红细胞，如贴附法，即外周血置塑料瓶内37℃培养1小时，取上清内的细胞，其结果造成细胞产量降低，T细胞百分比增加，B细胞比列下降。用吞噬法，即抗凝外周血加5%矽（Silica），37℃1小时，再用Ficol分离，也会形成淋巴细胞产率低，B细胞比例少，T细胞上升，同时矽也会造成细胞荧光强度增加。NH4CI3处理红细胞也会影响T淋巴细胞亚群的百分数。因此，在外周血标本制作过程中，细胞分离程序不宜太复杂，否则会影响亚群的分布关系。当然，任骨髓标本的制作时，也要充分考虑骨髓的吸收及处理方法，不然会形成系统误差。
免疫荧光染色方法
直接染色法：荧光色素直接交联抗体。1、1×106细胞于尖底离心管内，加荧光标记抗体，4℃放置15—30分钟。如做双标记染色，可把两种抗体直接加入。2、冷20%小牛血法，0.1%NaN3 1/15M PBS（PH4.4）洗细胞2次加入适量缓冲液待测。
间接染色法：1、1×106细胞加特异的第一抗体，4℃15—30分钟。2、加缓冲液洗2次，吸尽残留液体，弹起沉淀，加入荧光标记的第二抗体，4℃30分钟。3、缓冲液洗2次，加适量液体待测。全部操作尽量在4℃或水浴中进行，减少无关因素干扰。
直接染色法敏感性比间接稍差，但操作简单，适用同一细胞群体的多种标记的同时测定。
染色中的注意事项1、为减少非特异性干扰，荧光标记物用前应该用0.22um滤膜过滤或20000—50000g离心5分钟，去除颗粒或沉渣。2、为增加敏感性，可用三步间接染色法，即细胞加鼠单克隆抗体加羊抗鼠Ig血法+FITC兔抗羊IgG F（ab’）。此举可测到常规两步法查不到的抗原成分，但因层次加多，也受非特异性背景限制。3、某些细胞带有Fc受体，可同试剂非特异结合，用F（ab’）片段可解决此问题。人的单核细胞、巨噬细胞、粒细胞所含Fc受体都比T、B、NK细胞多，而后者的亲和力也低，可用调整抗体种类来克服。因有人认为鼠抗体对人血细胞的Fc受体非特异性结合顺序是IgG2>IgG1>IgM，而兔抗体的非特异性结合比羊抗体强。4、细胞标本的制备、染色及保存都应尽量保持新鲜，防止调变或分解代谢引起的表面抗原消失及细胞死亡，可通过加入营养培养基、低浓度血清、0.1%NaN3、4℃或冰浴中操作来解决。5、在稀少细胞或比例低的细胞亚群分析时，为保证准确、应排除死细胞。
