多步核分离和染色程序
Vindelv等人1983年报道了对实体组织(包括肿瘤组织)长期贮存、脱核制备和染色的多步综合处理,这种方法采用胰酶消化和PI染色,广泛地用于人和属各种实体组织的脱核染色制备。制备的流程如图所示。
多步分散程序流程图
多步分散程序的方法为:首先制备几种工作溶液。
柠檬酸缓冲液:将85.50g蔗糖(250mM)、柠檬酸三钠。2H2O,11.76g(40mM)溶于约800ml蒸馏水,再加入50ml二甲基亚砜(DMSO),加入蒸馏水至总体1000ml,pH7.6。
贮液:贮液用于制备A液、B液、C液和流式细胞计的鞘液中。将2000mg(3.4mM)柠檬酸三钠·2H2O,2000ul(0.1%V/V)NonidetP40(NP40),1044mg(1.5mM)四氯酸精胺,121mg(0.5mM)羟甲基甲胺(Tris)加入蒸馏水中,使总体积为2000ml,pH7.6.
A液:将15mg胰酸溶于500ml贮液中,pH7.6.
B液:将250mg胰酶仰制剂和50mg RNA酶A溶于500ml 贮液中,pH7.6.
C液:将208mg PI和580mg四氯酸精胺加至500ml贮液中,pH7.6,注意C液在制备、贮存和染色过程中都应避光。
染色溶液的长期贮存方法:分装成5ml的染液在塑料管中存贮于—80℃中。使用前,将贮存的染液立即入37℃的水浴中。然后将A液和B液在室温下保存,直到使用,C液保持在水浴中。
细胞的长期贮存方法:不立即进行染色和分析的样品,可以长期冰冻保存。具体方法是:将柠檬酸缓冲液每400ul分装在聚丙烯管中,每管可悬浮大约106细胞,将管立即浸入干冰和99%乙醇(—80℃)的混合液中,然后存贮于—80℃冰箱中。分析前,将样品迅速地置于37℃水浴中,准备染色。
染色方法:将1800ulA液加到200ul柠檬酸缓冲液的细胞悬液中,将管慢慢倒置,混匀。在室温下,10分钟内,将管轻轻上下倒置5一6次,然后加入1500uIB液,在室温下,10分钟内轻轻上下倒置几次。再加入1500uIC液(原在水浴中),轻轻将管倒置。避光条件下,通过一个30um的尼龙网过滤样品,然后将样品置入冰浴中,加入C液染色后,在15分钟到3小时之间,可进行流式光度分析。
这种方法很适用于没有固定的针吸样品。非离子去污剂用于溶解细胞,精胺用于稳定未固定的核。精胺的适用浓度是很严格的,浓度如偏低对稳定核膜无效,浓度偏高将导致胞核、胞质和未溶解细胞的污染。胰酶能消化细胞质碎片,胰酶仰制剂使胰酶失活,RNA酶可除去RNA的非特异荧光。PI用于DNA荧光染色(参见荧光探针PI染色)。
这种方法的实验结果表明:样品在—80℃存贮并经去污剂处理和胰酶消化,细胞丢失很少,所获得细胞核的DNA分布与用同种样品获得单个细胞DNA分布是类似的,细胞周期各时相百分数也是类似的。DNA分布显示出很小的细胞从结,可获得很低的CV值。DNA染色是高度定量的,能够区分DNA的微小差别(例如人类性染色体)。应指出的是:如果原样品中组织高度坏死或化疗引起大量细胞死亡,核分散处理后将会产生一些自溶的核和很多碎片,来自坏死组织的核比来自活细胞的核光散射值和荧光强度都高。另外,来自鼠精子的荧光强度比预料的要低。
总之,使用核悬液的优点是容易获得、DNA分布的质量高以及适用于小量的临床针吸样品。