细胞内pH
细胞内pH、膜电位和细胞内钙都是细胞激活过程中重要的细胞参量。实验表明：外源凝集素刺激淋巴细胞后几分钟内出现细胞内pH值的增加。流式细胞术多参量（DNA和pH）测量表明，细胞周期移行过程中，增殖期细胞比静止期细胞更偏碱性。此外，实验还证明，实体瘤中有一些区域，它们中的pH值显著低于正常组织，可能是由于这些细胞缺氧产生乳酸所造成。
流式细胞术中采用的pH荧光探针很多，较常用的有BCECF（2’7’-bis（Carboxyethyl）-5,6-Carboxy Fluorescein，2’7’二羧乙基-5,6羧基荧光素）和6-COFDA（6-Carboxy Fluorescein Diacetate，6-羧基二醋酸酯荧光素），这两种pH荧光探针都是荧光素的衍生物。还有DCH（2,3-Dicyano-hydrochinone，2,3二氰基氢醌）以及SNARF系列（Seminaphthorhodafluor）和SNAFL系列（Seminaphthof-luorescein）pH指示剂。
BCECF的激光光谱是pH依赖性的，在低pH环境中激发峰为450nm，高pH环境中激发峰为500nm，其发射峰对pH不敏感，约为530nm。用BCECF测量细胞内pH采用比例法，即分别用500nm和450nm激发BCECF所得到的530nm发射荧光之比。在生理pH有很好的线性关系，被估计的细胞内pH的最大分辨率为0.4pH单位。用比例荧光测量pH的好处是，测量值不受染料进入细胞多少、细胞的厚度、光猝灭情况以及染料漏出等影响。试验中BCECF比例荧光与pH的关系必须被校准。作校准曲线的方法是：将细胞与已知pH值并加有质子载体尼日利亚菌素（nigericin）的缓冲液达到平衡后，对应几组不同pH值的缓冲液，分别测出荧光发射的比例，可以获得pH校准曲线。质子载体的作用是能转运质子通过细胞膜，使膜内外pH值相等。此外应注意校准曲线是与测量仪器、所用染料有关系的，必须严格控制作标准曲线时和实验时各种条件的一致性。
BCECF不能直接进入细胞，通过它的乙酰甲酯（aceto-xymethyl ester）BCECF-AM能够进入细胞中，在细胞内被酯酶水解后，释放出BCECF分子。BCECF在细胞内不进入线粒体和其它酸性室如溶酶体，只限于胞浆中，所以测的是细胞质pH。
BCECF对于多数细胞滞留性好，不容易从细胞中漏出来。如果用BCECF-AM标记细胞后，
重新悬浮在缓冲液中，在4℃，两小时内染料仍有95%滞留于细胞中，所以背景荧光低，信噪比大。总之，由于BCECF能够估计将近2单位的pH值，荧光仅限于胞浆内并且较稳定等特性，使它成为较常用的pH荧光探针。
COFDA的光谱特性与BCECF类似，低pH下激发峰为450nm，高pH下激发峰为495nm，发射峰约为520nm。比例测量是分别以495nm和450nm激发COFDA所得到的520nm发射荧光的比例。
COFDA是通过二醋酸酯导入细胞中，在细胞内被酯酶水解后，释放出羧基荧光素分子，由于它不进入线粒体中，所以可以估计细胞浆pH值，此外COFDA在细胞内滞留特性也较好。
DCH荧光对pH值有很强的依赖性。DCH通过它的酯ADB（1，4-diacetoxy-2,3-dicyano-benzene）进入细胞，然后被酯酶水解成为DCH。DCH在细胞中的分布，约有10%的染料进入细胞器中。当pH为6—7.6时，溶液中的DCH激发峰为350nm，发射峰为460nm。比例法测量为：紫外光激发，测量荧光发射425/540nm的比例；所得结果可以估计pH值为6—7.6的范围，分辨率可达0.2pH单位。DCH标记细胞后10分钟，荧光达到最强，随后染料逐渐漏失，在4℃染色30分钟后，约漏掉50%的染料，染色后10—30分钟内，荧光比例是稳定的，可进行流式测量。
近年来又合成了一些新的细胞内pH荧光探针，例如SNARF和SNAFL系列pH荧光探针，这类探针对于测量6.3—8.6范围的pH值是很有用的。他们有两个发射峰，在酸性溶液中发黄色或橙色荧光，在碱性溶液中发红色荧光。由于其间有一个不依赖于pH值的等发射点，故可采用以同一激发波长激发样品，测量两个发射峰比例的方法。这类探针的另一特点是其吸收光谱也依赖于pH而变化，所以也可采用以两个激发波长激发样品，测量同一发射荧光的激发比例法。可根据仪器条件，选择一种比例法测量细胞内pH值。测量前，必须作pH值与比例值之间的校正曲线。由于这类染料适于较长波长激发，所以可用氩离子激光器激发。
SNARF和SNAFL的乙酰甲酯SNARF-AM和SNAFL-AM很容易通过膜进入细胞中，并且比羧基荧光素在细胞内的滞留性能好，是一种很有前途的pH荧光探针。使用时，先以1nM的浓度溶在干燥的DMSO中（放热防潮），使用前立即用缓冲液稀释贮液，标记细胞的终浓度为1—5uM。
