酶联免疫吸附测定
目的要求
1、学习酶联免疫吸附测定原理
2、掌握酶联免疫吸附测定技术，定量测定抗体或抗原。
实验原理
1971年，Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosor-bent assay，ELISA）用于IgG定量测定的文章，使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。这一方法的基本原理是：使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。再使抗原或抗体与某种酶链接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体即保留免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。
根据检测目的的不同可将ELISA分为一下几型：
（1）、直接法。将抗原吸附在载体表面，加酶标抗体，形成抗原一抗体复合物，加底物。底物的降解量=抗原量。
（2）、间接法。将特异性抗原与固相载体链接形成固抗相抗原。清晰除去未结合抗原。加入受检标本使之与固相抗原结合（样品中特异性抗体与固相抗原结合，形成固相抗原-抗体复合物）。清晰除去其他未结合的物质。加入酶标记抗免疫球蛋白（抗抗体，二抗），它与固相复合物中的抗体结合。固相载体上的酶量就代表特异性抗体的含量。加入底物显色，在20～60min内观察显色结果。酶催化底物变为有色产物，根据颜色反应的深度进行抗体的定性或定量检测。
（3）、双抗体夹心法。将特异性抗体与固相载体链接即包被，形成固相抗体。清洗除去未结合的抗体。加入受检标本使之与固相抗体结合（样品中特异性抗原与固相抗体结合，形成固相抗原-抗体复合物）。清洗除去其他未结合的物质。加入酶标记抗体。固相免疫复合物上的抗原就可以与酶标记抗体结合。加入底物显色，在20～60min内观察显色结果。酶催化底物变为有色产物，根据颜色反应的深度进行抗原的定性或定量检测。本法只适用于二价或二价以上大分子抗原，而不适用于半抗原的检测。
（1）、竞争抑制法。将特异性抗原与固相载体链接形成固相抗原。清洗除去未结合的抗原。同时加入受检标本和抗原使之与固相抗原竞样品中特异性抗体与固相抗原和游离的抗原竞争结合，形成固相抗原-抗体和游离的抗原-抗体结合（抗体复合物）。清洗除去其他未结合的物质和游离的抗原-抗体复合物。加入酶标记抗免疫球蛋白（抗抗体，二抗），它与固相复合物中的抗体结合。固相载体上的酶量就代表特异性抗体的含量。加入底物显色，在20～60min内观察显色结果。酶催化底物变为有色产物，根据颜色反应的深度进行抗体的定性或定量检测。
试剂和器材
（1）、试剂
辣根过氧化物酶兔抗鼠IgG，工作稀释度1:1000。
包被液：0.05mol/L，PH9.6碳酸缓冲液，4℃，保存，Na2CO3,0.15g，NaHCO3，0.293g，蒸馏水稀释至100mL。
稀释液及洗涤液：0.01mol/L，pH7.4 PBS-Tween-20,4℃保存，NaCI ,8g，KH2PO4，0.2g，Na2HPO4·12H2O，2.9g，Tween-20，0.5mL，蒸馏水加至1000mL。
封闭液：0.5%鸡卵清蛋白，pH7.4PBS。
邻苯二胺溶液（底物）：临用前配，0.1mol/L，柠檬酸（2.1g/100mL）6.1mL，0.2mol/L，Na2HPO4·12H2O（7.163g/100mL）6.4mL，蒸馏水12.5mL，邻苯二胺10mg，溶解后，临用前加30% H2O2，40uL。
终止液：2mol/L，H2so4。
（2）、材料
取一定量的甲胎球蛋白免疫兔制备抗血清。阴性对照血清。
（3）、器材
聚苯乙烯微量反应板（40孔或96孔），可调试微量吸液器（200uL），封口膜小烧杯，试管，37℃恒温箱，酶联免疫检测仪。
操作方法
（1）、包被抗原。用包被液将抗原作适当稀释，一般为1～10ug/孔，每孔加200uL，37℃温育1h后，4℃冰箱放置16～18h。
（2）、洗涤。倒尽板孔中液体，加满洗涤液，静放3min，反复3次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽。
（3）、加封闭液200uL，37℃放置1h。
（4）、洗涤同（2）。
（5）、加被检血清。用稀释液将被检血清作几种稀释，每孔200uL。同时作稀释液对照。37℃放置2h。
（6）、洗涤同（2）。
（7）、加辣根过氧化物酶鼠抗兔IgG，每孔200uL，37℃放置1h。
（8）、洗涤同（2）。
（9）、加底物。邻苯二胺溶液加200mL，室温暗处10～15min。
（10）、加终止液：每孔50uL。
（11）、观察结果：用酶联免疫检测仪记录490nm读数。
注意事项
（1）、酶标记抗体以及待检样本的使用浓度应事先滴定。
（2）、保存的血清切忌反复冻融，以免降低血清中抗体或抗原的免疫学活性。
（3）、酶-底物反应时间除人为规定（常规规定为30min）外，还可以阳性参考标本的OD值达到1.0时为反应终点。
（4）、底物液一定在临用前现配。
