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流式细胞术的发展简史

点击次数:1422次     发布时间:2016/3/17 13:29:55

  流式细胞术(Flow Cytometry, 简称FCM)是对细胞货细胞器快读测量的高技术。依赖测量的参数,还可以用物理的方法将一个群体中的亚群分选出来,这就是流式细胞分选术。上述的“流式”,指的是在测量过程中细胞是流动的,不是静止的,这是与在此前对细胞测量技术的最大差异之处。流式细胞书目前在国外的一些有关实验室、医院已发展成常规技术,在我国经过十年的推广也逐渐普及。经过数十年的努力,流式细胞术从一个只能计数,稍后可测粒子大小的一起,发展到今天可快速测定同一个细胞的多种化学和物理的特性,这中间凝集这许多人的心血,既有成功也是失败。
   第一个报道自动计数细胞的是Moldavan(1934年),他描述了一个装置:悬浮的红细胞或是用中性红染色的酵母,在显微镜的载物台上从一个毛细玻璃管中流过,每个通过的细胞可别一个光电装置记录下来。他注意到了一系列技术上的细节。但此后一直没有进一步的报道。现在,人们把这个实验看成是有关流式细胞术的第一个尝试。1941年,Kie-lland申请了一个专利,大体上与Moldavan差不多,没有什么更新的内容。
通过这些实验,人们发现,在流式细胞计数细胞要流过的狭窄管道中存在的最大问题是大细胞货细胞团阻塞通道,为解决这个困境,人们不禁想起1883年和Reynolds用来研究管子中层流时使用的鞘液原理。Guker等人在1947年就是用这个原理个光电技术结合起来对气溶胶中的粒子进行计数。随后。Grosland-Taylor利用同一原理在1953年设计了一个流动室,用光学方法来计数血细胞。他让悬浮的细胞慢慢地注入快速流动的液柱中,这个液柱外面被层流鞘液包围着,粒子在轴心流动。这样做有两个好处:一是消除了大个颗粒阻塞现象;二是它可精确控制粒子进入液柱的位置,使之在轴心上,这样就建立了流体动力聚焦的原理。今天,几乎所有的流式细胞术的液流原理都擦私用了上述技术。
1949年,Wallance Coulter申请了一个名叫“流动的悬浮粒子技术方法”的专利,在专利的方法中,他使粒子通过一个小孔。只要粒子与悬浮的介质间在电导率上有差异,小孔中粒子的存在与否即能引起可检测出的电特性变化,此现象通常被称为Coulter效应,他在次基础上生产了Coulter计数器(1956年)此后还有一些人发展了各种粒子测量设备,但原理都差不多。其中Parker和Horst在1953年申请的专利“同时计数红白细胞的方法”,是用稀释的血细胞悬浮在等渗液中,白细胞变成蓝色,红细胞认为红色。细胞通过一根导管再被一束光照射,透射光被分成红、蓝两个成分病分别送到光电池上,这样就可纪录通过的细胞是吸收了蓝光还是红光。于是不上单纪录了通过的细胞数目,还识别了通过的细胞是白细胞还是红细胞,这已经有点今日流式细胞术的意思了。此后,知道60年代中期,流式细胞术始终无多大进展.红细胞稀释液。
1965年,Kamentsky提出两个新概念:意识用分光光度学定量测量细胞组分;另一个是细胞的不同组分可以被同时多参数测量,用以给细胞分类。最初曾用核算的紫外吸收和可见光散射两个参数同事测量未染色的细胞,测量的速度大约是每秒测50个细胞。他同时也是第一个用两维直方图显示并分析多参数流式细胞术的人。他也是第一个用计算机接口到仪器上,记录并分析多参数数据的人。他的这个装置随后改装成商品仪器,商品名为Ortho Cytograph和Cytofluorograph.
1968年,Dittrich和Gohde在英国申请了一个专利,名称是“在分散体系中自动测量和计数粒子的装置”。他们在测量粒子的荧光或磷光时,让粒子平行于透镜光轴的方向运动,并通过大数值孔径物镜的焦面,粒子通过焦面后再用一个冲洗液使之偏转。该装置使用了Kohler照明,因而在粒子运动的出口处可得到均匀的照明,这就免去了聚焦的问题。这样一个设备可以用Kohler照明进行荧光的激发,也可以手机发散的荧光,光源使用氙灯或高压汞灯。采用大的数值孔径透镜保证了激发光和收集发射光都有大的立体角,而较大的立体角又可在测量非对称细胞时细胞不同的取向不致使信号发生变化。Gohde以很小的变异系数测量了细胞群体的DNA。按上述原理制成的商品名称为Phywe Impulscytophotometer简称ICP,随后生产的ICP22,直到今天还有人仍在使用。
 在1967年,Van Dilla和Los Alamos小组率先发展了一种液流束、照明光轴,检测系统光轴三者互相垂直的流式细胞计。这种不依赖显微镜的设备采用了由Crosland-Taylor设计的层流流动室并使用氩离子激光器为照明光源。这种垂直相交的系统以后更进一步发展,除了可测荧光外还可测量散射光,后来还把Coullter计数器也安装进去。他们第一个用荧光Feulgen反应对细胞DNA染色,展示了DNA倍性和荧光间的线性关系,他们的DNA直方图第一个清楚的显示出细胞周期的G1时相、S时相,G2和M时相。他们第一个用同步培养的细胞论述了定量细胞动力学,而Gohde和Dittrich则是第一个用流式细胞术测量DNA以确定细胞周期变化来研究药物影响细胞周期动力学的人。
至于历史细胞分选术,则首先是由Fulwyler在1965提出的,其改进型是在1969年。他使用了Sweet在1965年使用的一个静电墨水喷射液偏转技术。这个技术原来装在Coulter计数器上可使细胞按体积大小分类。与此同时,也是在1965年,Kamentsky独立地申请了一个专利,这是一个在液流中经过光度学货电学测量后分选细胞的方法。在此方法中利用了气体动力学、水力学和静电学的技术。后来Friedman曾设计过一个用液流开关分选的装置,但较少使用,直到今天分选用的大部分仍然是电子学的方法,如Becton Dickinson公司的各种课供使用的FACS仪器仍然在应用液滴偏转的原理。
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