PCR扩增DNA片段

聚合酶链反应（Polymerase chain reaction ,PCR)是一种体外DNA 扩增技术，1985年由Mullis等人创立。该技术能在几小时的实验操作中，将认为选定的一段DNA扩增几百万被，具有灵敏度高、特异性强、操作简便和应用广泛等优点、可用于基因克隆、定点突变及序列分析。也可用于基因表达调控研究、遗传病和传染病基因诊断、基因多态性分析和法医鉴定等领域。

PCR的工作原理类似于DNA的天然复制过程，这将代待扩增的DNA片段和其两侧互补的寡核苷酸链引物经变性、退火及延伸三部反应的多次循环，可使特定的DNA片段在数量上呈指数增加。可用公式Y=(1+X)表示，式中Y=DNA扩增倍数，X=扩增效率，n=循环数。如X=100%,n=20时，Y=1048576倍。PCR的一个循环为（1）加热使模板DNA在高温（94℃）下变性，双链解开，这是变性阶段；（2）降低溶液温度，使引物在低温下（50℃）与模板DNA互补退火形成部分双链，这是退火阶段；（3）溶液温度升至中温（72℃），在TaqDNA聚合酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制七点，模板DNA的一条双链在解链和退火之后延伸为两条双链，这是延伸阶段。通过改变反应温度即高温变性、低温退火、中温延伸三个阶段，构成PCR的一个循环。╮(╯_╰)╭循环一次，特定DNA片段拷贝数扩大一倍。一般30次循环，DNA片段放大数百万倍。

试剂

购买TaqDNA聚合酶，10x扩增缓冲液，dNTP.

设计并合成与目的DNA两侧互补的引物。

制备模板DNA。用牙签挑取单菌落悬浮到50ul的裂解液中（裂解液1%Triton X-100,20mmol/L Tris·Cl ph8.2 2mmol/L EDTA),95℃，10000rpm离心5min ，取5ul上清液用于总体积100ul的PCR反应。

器械

PCR扩增仪

台式高速离心机

移液器

经高压灭菌后的离心管

电泳仪

实验方法

1、按一下次序，将下列成分在0.5ml灭菌离心管内混合

灭菌水                                  30ul

10x扩增缓冲液                           10ul

4种dNTP混合物，每种浓度为1.25mmol/L   16ul

引物1                                   100pmol

引物2                                   100pmol

模板DNA                                5ul

加水至终体积                            100ul

2、于94℃加热反应混合液5min，使DNA完全变性。

3、将1ul TaqDNA聚合酶加入仍处于94℃的反应混合也中。

4、用100ul石蜡油覆盖于反应混合液之上，放置水蒸发。

5、按94℃变性1min，50℃退火2min，72℃延伸3min次序重复魂环25-30次（为克隆目的）。末轮循环的72℃延伸时间为10min。

6、取出样品离心管，自然冷却后进行琼脂糖凝胶电泳鉴定或置-20℃保存。若有必要，可将移液器吸头深入下层水相，将含DNA的水相移入一清洁管中，用等体积三氯甲烷抽提样品以除去石蜡油。

注意事项：

1、TaqDNA聚合酶应在临扩增前现加。

2、扩增前需充分混匀反应混合液。

3、所用离心管需经高压灭菌。

4、PCR反应特异性强，引物浓度不宜过多。

5、引物设计要合理，一般引物长度为18-30个核苷酸，成对引物间的G+C含量应相似。