枯草芽孢杆菌蛋白酶活力测定
缓冲液

酶试剂是磷钨酸和磷钼酸的混合物，它在碱性条件下极不稳定，可被酚类化合物还原产生蓝色（钼蓝和坞蓝的混合物）。

酪蛋白经蛋白酶作用后产生的酪氨酸可与酚试剂反应，所生成的蓝色化合物可用分光光度法测定。

（1）酚试剂：见实验1-15Folin试剂乙；（2）0.55mol/L碳酸钠溶液；（3）10%三氯乙酸溶液溶液；（4）0.5%酪蛋白溶液；称取酪蛋白2.5g，用0.5mol/L的氢氧化钠溶液4ml润湿，加0.02mol/L ph7.5磷酸缓冲液少许，在水浴中加热溶解。冷却后，用上述缓冲液定容至500ml。此试剂临用时配制；（5）0.02mol/L ph7.5磷酸缓冲液；称取磷酸氢二钠（NaHPO4·12H2O）71.64g,用水定容至1000ml为A液。称取磷酸二氢钠（NaHPO4·2H2O)31.21g,用水定容至1000ml为B液。取A液840ml，B液160ml，混合后即成0.2mol/L（ph7.5）磷酸缓冲液。临用时稀释10倍；（6）100ug/mL酪氨酸溶液；精确称取烘干的酪氨酸100mg，用0.2mol/L盐酸溶液溶解，定容至100ml，临用时用水稀释10倍，在分别配置成集中10-60ug/mL浓度的酪氨酸溶液（7）酶液；称取1g枯草芽孢杆菌蛋白酶的酶粉，用少量0.02mol/L ph7.5的磷酸缓冲液溶解，然后用同一缓冲液定容至100ml。震摇约15min，时期充分溶解，然后用干纱布过滤。吸取滤液5ml，稀释至适当倍数（如20/30或40倍）供测定用。此酶液可在冰箱中保存一周。

操作

1、绘制标准曲线

取不同浓度（10-60ug/mL)的酪氨酸溶液各1ml，分别加入0.55mol/l碳酸钠溶液5ml，酚试剂1ml。置30℃恒温水浴中显色15min，用空白管（只加水，碳酸钠溶液和酚试剂）做对照测定A680,以A680为纵坐标，酪氨酸的微克数为横坐标，绘制标准曲线。

2、酶活力测定

吸取0.5%酪蛋白溶液2ml置于试管中，在30℃水浴中预热5min后加入预热（30℃ 5min）的酶液1ml，立即计时。反应10min后，由水浴取出，并立即加入10%三氯乙酸溶液3ml，放置15min后，用滤纸过滤。

同时另作一对照管，即取酶液1ml先加入3ml10%的三氯乙酸溶液，再加入0.55mol/L的碳酸钠溶液5ml，混匀后再个加入酚试剂1ml，立即混匀30℃显色15min。以加水的一管做空白，侧对照及样品的A680.

计算

规定在30℃、ph7.5的条件下，水解酪蛋白每分钟产生酪氨酸1ug为一个活力单位，则1g枯草芽孢杆菌蛋白酶在30℃，PH7.5的条件下所具有的活力单位为；

(A样-A对）·K·N

式中A样；样品液的A680; A对；对照液的A680; K；标准曲线上A680为1时的酪氨酸微克数；t；酶促反应的时间（min），本实验 V:酶促反应管总体积（ml），本实验V=6； N:酶液的稀释倍数，本实验N=2000.