动物细胞的分离及冻存、复苏
为了进行细胞培养，首先要从生物体去的细胞，目前获取细胞的方法有两种，即离心分离法和消化分离法。
1、离心分离法
离心分离法主要用从含有细胞的体液如血液、羊水、腹腔水中分离细胞。此时一般用800-1000r/min的速度离心5-10min即可。离心速度过高或时间过长，易挤压细胞使之受伤或死亡。
2、消化分离法
消化分离法是先从生物体取来的组织块，将其剪碎，并用消化液将其笑话，使组织松散呈细胞悬液，然后用缓冲液洗涤、离心、去除残留的消化液而获得所需的细胞。
常用的笑话液有胰蛋白酶、乙二胺四乙酸（EDTA）、或胰酶-柠檬酸盐、胰酶-EDTA联合使用。目前最常用的集中消化液配制方法如下：
1%胰蛋白酶溶液的配制
称取胰蛋白酶10g，用少量Hanks液先将胰蛋白酶调成糊状，补足Hanks液至1000ml，振摇混匀，置于4℃冰箱内过夜，过滤除菌，分装小瓶，低温冰箱冰冻保存，同时取样做无菌实验。使用时用Hanks液稀释成0.25%或0.125%，并用NaHCO3调至PH=7.0或偏碱性。
0.02%EDTA溶液的配制
称取EDTA0.2g，用1000ml Hanks溶液溶解。8磅 15-20min高压灭菌，分装小瓶，4涉世度冰箱保存备用，同时留样做无菌实验。
胰酶-柠檬酸盐配制
胰酶（1:250）2.50g，柠檬酸三钠2.96g，NaCL6.15g,酚红（1%）1.5ml，无离子水1L。
用NaOH调至PH=7.5，过滤除菌，分装小瓶，并作无菌实验。
胰酶-EDTA溶液的配制
取1份0.025%胰酶或胰酶-柠檬酸盐溶液加4份0.02%EDTA溶液构成，可先用现配，也可事先配好，分装低温保存备用。
细胞的冻存
细胞和整体生物一样，当温度降低时，他的代谢也降低，从而大大的延长了他的存活期。因此目前为了保存细胞，都采用液氮低温冻存的方法，用该方法细胞可保存几年甚至几十年。在冻存过程中，渗透压的改变会影响到脂蛋白，使细胞膜破裂，为了防止电解质过分浓缩，可采用某些保护剂，如甘油和二甲基亚砜。他们的相对分子量低，易于溶解，容易渗入细胞，在冷冻时，冷冻速度很重要，不能太快也不能太慢。太慢会产生冰晶损伤细胞，太快不足以是水分排出。一般要求以1℃/min的速度健将为宜。在无定速降温设备时，可按如下三种方法处理1 将安瓿放入壁厚为1.5cm的聚乙烯盒内，然后放入-70℃冰箱内2h，在转入液氮。2将安瓿置于4℃冰箱4-5小时或过夜，在移至-70℃冰箱内2小时，在选育液氮茎口1小时最后浸入液氮。3放在冻存简易装置内，置于液氮罐茎口，离液氮面5-10cm，2-3小时候浸入液氮。
细胞冻存中还有几点注意事项
1、冻存的细胞需处在良好的营养状态，故在冻存前一天要换液培养。
2、细胞密度以1*10六次方或2*10六次方为好
3、配制东村用培养基要与实际使用一致，另加入保护剂二甲基亚砜或甘油10%，二甲基亚砜要过滤除菌，不要用高压蒸汽灭菌。
4、分装安瓿若用玻璃的安瓿，封口后要检查其密封性，可将其浸入甲基蓝乙醇溶液，若有裂纹，可见蓝色进入安瓿。
5、标签上要写上细胞名称，编号和冻存日期，最好外面再贴一层透明胶纸。
细胞的复苏
复苏时，总的要求是要快熔，在实际操作中应注意如下几点
1、为了防止因玻璃安瓿封口不好，在融化时渗入的液氮引起安瓿爆炸，在操作中药注意防护，戴面罩和手套。
2、从液氮罐中取出的安瓿，应立即丢入37-40℃的温水搪瓷杯中（玻璃烧杯，容易爆炸），并胶东加速融化，
3、用乙醇消毒安瓿外表。
4、由于二甲基亚砜对细胞有一定的毒性，故应尽早去除，或将细胞离心，换上新鲜培养基或先将细胞悬液直接种入培养瓶中（加入10ml培养基），4-6小时后，代细胞贴壁后立即换液。
5、隔天观察细胞生长情况，再换液一次。
