超氧阴离子(OFR)含量检测试剂盒
货号：H0142

规格：50T/48S

注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

产品内容：

提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存。

试剂一：液体32mL×1瓶，4℃保存。

试剂二：液体25mL×1瓶，4℃避光保存。

试剂三：液体25mL×1瓶，4℃避光保存。

试剂四：氯仿，自备。    

亚硝酸钠标准品：液体1mL×1支，4℃保存。10μmol/mL亚硝酸钠。

产品说明：

生物体内超氧阴离子等活性氧具有免疫和信号传导的作用，但积累过多时会对细胞膜及生物大分子产生破坏作用，导致机体细胞和组织代谢异常，从而引起多种疾病。

超氧阴离子与盐酸羟胺反应生成NO2－，NO2－在对氨基苯磺酰胺和萘乙二胺盐酸盐的作用下，生成红色的偶氮化合物，在530nm有特征吸收峰，根据A530值可以计算样品中O2－含量。

自备实验用品及仪器：天平、水浴锅、离心机、可见分光光度计、1mL玻璃比色皿、氯仿和蒸馏水。

操作步骤：

一、超氧阴离子提取

1.植物、动物组织：称取约0.1g样本，加入提取液1mL，充分研磨，12000rpm，4℃，离心20min，取20μL上清测定蛋白含量，其余上清作为待测样本。

2.血清或培养液：直接测定

二、测定操作表

1、分光光度计预热30min以上，调节波长至530nm，蒸馏水调零。

2、标准溶液的制备

称取适量亚硝酸钠标准液，首先16倍稀释至 0.625µmol/mL,然后进行倍比稀释至 0.3125、0.15625、 0.078、0.039、0.0195、0.009765、0.0049、0.00244、0.0012、0.0006µmol/mL 梯度稀释的标准溶液， 用0.3125、0.15625、0.078、0.039、0.0195、0.009765、0.00244、0.0006µmol/mL 标准管做标准曲线。

3、操作表

	空白管	测定管	标准管
标准溶液（mL）			0.2
样本（mL）		0.2
提取液（mL）	0.5	0.3	0.3
试剂一(mL)	0.4	0.4	0.4
混匀，37℃水浴20min
试剂二（mL）	0.3	0.3	0.3
试剂三（mL）	0.3	0.3	0.3
混匀，37℃水浴 20min
试剂四（mL）	0.5	0.5	0.5
混匀，8000rpm，25℃，离心 5min，小心吸取上层水相 1mL，蒸馏水调零， 1mL 玻璃比色皿，测定 A530。计算∆A 标准=A 标准管-A 空白管，∆A 样品=A 测定管-A 空白管。每次实验空白管仅需做一管。

三、超氧阴离子含量计算公式

1.标准曲线的绘制

以∆A 标准为 y 轴，标准溶液浓度为 x 轴，绘制标准曲线 y=kx+b。

2.超氧阴离子含量的计算

将∆A 样品带入方程得到 x 值（µmol/mL）

（1） 按照样本鲜重计算

超氧阴离子含量（µmol/g鲜重）= 2x×V 样本÷（V 样本÷V 提取×W）=2x÷W。

超氧阴离子产生速率（µmol/ min/g鲜重）= 2x×V 样本÷（V 样本÷V 提取×W）÷T=0.1x÷W。

（2） 按照蛋白质浓度计算

超氧阴离子含量（µmol/min/mg prot）= 2x×V 样本÷（V样本×Cpr）=2x÷Cpr。

超氧阴离子产生速率（µmol/min/mg prot）= 2x×V样本÷（V 样本×Cpr）÷T=0.1x÷Cpr。

(3) 按照血清或培养液体积计算

超氧阴离子含量（µmol/mL）= 2x

超氧阴离子产生速率（µmol/min/mL）= 2x÷T=0.1x。

V 样本：参与反应样本体积，0.2mL；V提取：提取过程中加入的提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样品鲜重，g；T：反应时间，20min。

超氧阴离子(OFR)含量检测试剂盒注意事项：

1、OD值大于1.0，样品适当稀释再测定，注意计算公式里乘以稀释倍数。

2、样品制备好之后，立刻进行测定，请勿将样品进行长时间的低温保存，以免影响测定结果。

3、试剂四有一定的毒性，请操作时做好防护措施。