在elisa试剂盒实验中一般有两次抗原抗体反应，即加标本物和加结合物后，此时反应的温度和时间应按规定的要求，保温容器最好是水浴箱，可使elisa试剂盒实验中的温度保持平衡。elisa试剂盒实验中各elisa板不应该叠在一起。为了避免蒸发，板上应加盖，或者将板平放在底部垫有湿纱布的湿盒中，湿盒应该是金属的，传热容易。

ELISA属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。以抗体包被的夹心法为例，加入板孔中的标本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗结合的机会，只有最贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。这是一个逐步平衡的过程，因此需经扩散才能达到反应的终点。在其后加入的酶标记抗体与固相抗原的结合也同样如此。这就是为什么ELISA试剂盒实验反应总是需要一定时间的温育。

elisa试剂盒实验中温育常采用的温度有43℃、37℃、室温和4℃（冰箱温度）等。37℃是elisa试剂盒实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温度。在建立ELISA方法作反应动力学研究时，实验表明，两次抗原抗体反应一般在37℃经1-2小时，产物的生成可达顶峰。为加速反应，可提高反应的温度，有些elisa试剂盒试验在43℃进行，但不宜采用更高的温度。抗原抗体反应4℃更为彻底，在放射免疫测定中多使反应在冰箱中过夜，以形成最多的沉淀。但因所需时间太长，在ELISA试剂盒实验中一般不予采用。