货号: H0090
规格: 50T/48S

过氧化氢酶(CAT)活性检测试剂盒方法：紫外分光光度法

注意：正式测定之前选择2-3 个预期差异大的样本做预测定。

产品内容：

提取液：液体60mL×1瓶，4℃保存；

试剂一：液体60mL×1瓶，4℃保存；

试剂二：液体100μL×3瓶，4℃保存。

产品说明：

CAT(EC 1.11.1.6)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是最主要的 H₂O₂ 清除酶，在活性氧清除系统中具有重要作用。

H₂O₂在240nm下有特征吸收峰，CAT能够分解H₂O₂，使反应溶液240nm下的吸光度随反应时间而下降，根据吸光度的变化率可计算出CAT 活性。

试验中所需的仪器和试剂：

紫外分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1mL 石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水

过氧化氢酶(CAT)活性检测试剂盒操作步骤：

一、粗酶液提取：

1、细菌、细胞或组织样品的制备

细菌或培养细胞：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴个）：提取液体积（ml）为500-1000:1的比例（建议500万细菌或细胞加入1ml提取液），超声波破碎细菌或细胞（功率20%或 200w，超声3秒，间隔10秒。重复30次）；8000g 4℃离心10分钟，取上清，置冰上待测。

组织：按照组织质量（g）：提取液体积（ml）为 1：5-10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10分钟，取上清，置冰上待测。

2、血清（浆）样品：直接检测。
二、CAT 测定操作

1、 分光光度计预热30min以上，调节波长至240nm处，蒸馏水调零。

2、 CAT检测工作液的配置：用时在每瓶试剂二（100μL）中加入20ml试剂一，充分混匀，作为工作液；用不完的试剂4℃保存一周。

3、 测定前将CAT检测工作液 37℃（哺乳动物）或 25℃（其他物种）水浴10min。

4、 取 1mL CAT 检测工作液于1mL石英比色皿中，再加入35μL样本，混匀 5s；室温下立即测定 240nm

下的初始吸光值 A1和1min后的吸光值 A2。计算ΔA=A1-A2

三、过氧化氢酶(CAT)活性检测试剂盒活性计算：

1、 血清（浆）CAT活力的计算：

单位的定义：每毫升血清（浆）在反应体系中每分钟催化1nmol H₂O₂ 降解定义为一个酶活力单位。

CAT（U/mL）＝﹝ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹﹞÷V 样÷T=678×ΔA

2、 组织、细菌或细胞中CAT活力计算：

a. 按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化1nmol H₂O₂ 降解定义为一个酶活力单位。

CAT（U/mg prot）＝﹝ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹﹞÷（V样×Cpr）÷T=678×ΔA÷Cpr

b. 按样本鲜重计算：

单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟催化1nmol H₂O₂ 降解定义为一个酶活力单位。

CAT（U/g鲜重）＝﹝ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹﹞÷（W×V 样÷V 样总）÷T=678×ΔA÷W

3、 按细菌或细胞中CAT活力计算：

单位的定义：每 1万个细菌或细胞在每分钟反应体系中每分钟催化 1nmol H₂O₂ 降解定义为一个酶活力单位。

CAT（U/10⁴cell）＝﹝ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹﹞÷（500×V 样÷V样总）÷T=1.356×ΔA

V 反总：反应体系总体积，1.035×10^-3L；ε: H₂O₂ 摩尔吸光系数，4.36×10⁴L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.035ml；V样总：加入提取液体积，1ml；T：反应时间，1min。W，样本质量，g；Cpr：上清液蛋白浓度，mg/ml；500：细胞或细菌总数，500万